allr.genskov.ru



Культуры клеток и их условия выращивания

Сортировать: по оценкам | по дате
18.10.17
[3]
переходы:0
Культуры клеток и их условия выращивания
Первичные культуры могут быть также получены от кусочков ткани, объемом 1 мм, которые прикрепляются к поверхности субстрата благодаря собственной адгезивности или наличии насечек на чашке, или с помощью сгустка плазмы. В этих случаях будет происходить рост клеток из фрагментов. Клетки, мигрирующие из эксплантатов могут использоваться для пассивирования. Фрагменты ткани (эксплантаты) переносятся на новые чашки, мигрирующие клетки могут удаляться пересевом, смесью Версену и трипсина, а эксплантаты остающихся образовывать новые вырасти.
Как уже отмечалось выше, одним из методов получения клеточных линий перевиваемых является отбор клеток с повышенной активностью роста и размножения из популяции первичных культур. Отбор можно осуществить при регулярной смене среды, омывающей монослой первично трипсинизованнои клеточной культуры. Для этого отбирают матрасы с хорошо сформированным клеточным монослоем (сами матрасы должны иметь ровное дно и не должны иметь на стенках царапин и матовых пятен). Приготовленное для систематической изменения Ростове среду разливают по небольшим сосудам (чтобы исключить бактериальное загрязнение) и хранят при t - 4 °.
Изменение среды проводят регулярно, не реже 1 раза в неделю. В течение первых 3 недель заменяют по 20 - 30% объема ростового среды, в течение следующих 3 - 4 недель - 50 - 60%, позже проводят полную смену среды. Свежий среду непосредственно перед работой подогревают до t - 37 °.
Часть клеток округляется и отпадает от стекла. Большинство клеток стягиваются к центру, и монослоя приобретает звездчатый вид. Сами клетки при этом несколько удлиняются. Через 7 - 10 изменений среды в матрасах, как правило, начинают появляться новые клеточные элементы, причем в разных культурах они имеют разную морфологию.
В культуре клеток почки куриного эмбриона в центре монослоя или между стянутыми его участками появляются закругленные клеточные элементы, из которых постепенно формируются скопления в виде небольших колоний. В культуре клеток почки обезьяны появляются одиночные образования, напоминающие зерна. Клетки плотно прилегают друг к другу, образуя мелкие прозрачные колонии. Количество таких клеток нарастает медленно, размеры колоний также почти не увеличиваются. Колонии появляются не только на дне матраса, но также на боковых поверхностях, на границе питательной среды. Поэтому обязательным условием при изменении питательной среды является поддержание ее постоянного объема.
ru | allref.com.ua/uk/skachaty/Kul-tu...sologiya)?page=2


18.10.17
[1]
переходы:2
Культуры клеток и их условия выращивания
Для количественного накопления вирусов наиболее удобную систему представляют культуры клеток. Первые попытки культивирования клеток животных вне организма относятся к концу прошлого столетия. Эти отрывочные наблюдения указывали на возможность сохранения жизнеспособности тканей и клеток в искусственных условиях и положили начало глубоким научным исследованиям тканевых культур.
Большая заслуга в деле разработки методов культивирования тканей принадлежит Каррелю Он впервые доказал возможность размножения клеток животных в искусственных условиях и тем самым продемонстрировал их «бессмертие» и сходство с одноклеточными свободноживущими организмами. Значительных успехов в этом направлении достигла группа исследователей под руководством Эрла. Они первые получили рост большого числа клеток на стекле и в жидкой перемешиваемой суспензии. Появление антибиотиков и успехи в создании искусственных питательных сред открыли новую эру в развитии методов тканевых культур.
Перенос клеток целостного организма в условия жизни in vitro прекращает существование их как одного из многочисленных структурных элементов ткани или органа, в состав которых они ранее входили. При этом клетки выходят из-под контроля нейро-гуморальных факторов и приобретают ряд особенностей, зависящих как от самого факта отторжения клеток от этих тканей, так и от конкретных условий их существования in vitro.
Клетки, живущих вне организма, или ткани характеризуются целым комплексом метаболических, морфологических и генетических черт, резко отличных от свойств клеток органов и тканей in vivo.
Термином «первичная» обозначают клеточную культуру, полученную непосредственно из тканей человека или животных в эмбриональном или постнатальном периоде. Срок жизни таких культур ограничен. После определенного времени в них возникают явления неспецифической дегенерации, что выражается в грануляции и вакуолизации цитоплазмы, округлении клеток, потере связи между клетками и твердым субстратом, на котором они выращивались.
ru | allref.com.ua/ru/skachaty/Kul-tu...a_(virusologiya)


18.10.17
[1]
переходы:0
Культуры клеток и их условия выращивания
бутылей. Она не должна быть слишком большой, чтобы не препятствовать прикреплению клеток, но и не слишком низкой, поскольку длительное нахождение клеток в газовой фазе ухудшает условия их питания. В работах разных авторов скорости вращения бутылей варьировали от 8-12 об / час, до 1 об / мин. Наиболее подходящей для различных клеточных культур оказалась скорость вращения флаконов в пределах 0,5-1 об / мин. Рекомендуется в течение первых 30 мин. после посева клеток обеспечить высокую скорость вращения флаконов (0,5-1,0 об / мин) для равномерного распределения материалов, затем перевести их на низкую скорость вращения (20-30 об / час).
Посевная концентрация в 1 мл среды составляет для клеток СПЕВ, ВНК-21, HeLa, L - 60-80 тыс., Для диплоидных клеток 100-200 тыс., Для первичных культур - 200-300 тыс. Объем ростового среды должен составлять 1/10, 1/20 часть объема роллерного флакона. Роллерный метод культивирования позволяет получить большее количество клеток. Так, из флакона емкостью 3 л можно получить урожай клеток HeLa в 8 раз, ВНК-21 - в 9 раз, АД - в 11 раз больше, чем монослойного стационарной культурой флакона емкостью в 1 л. Кратность экономии сред при использовании 3-литровых флаконов составляет для клеток HeLa 2,8; ВНК-21 - 5,0, АО - 4,0. Способностью к росту и размножению в роллерных условиях обладает субкультура, культуры перевиваемых и реже первичные, а также диплоидные штаммы клеток. Для лучшего размножения клеток в роллерных аппаратах необходима адаптация их к новым условиям культивирования. Роллерный метод культивирования позволяет получить большие количества клеток. Преимуществом роллерных культур по сравнению с традиционными стационарными культурами являются, экономичное использование питательных сред и высокий выход вирусного антигена (на 1-2 lg)
В 1953 году Оуенс с сотрудниками впервые показал способность клеток размножаться в жидкой среде в свободно взвешенных состоянии. С тех пор метод суспензионного культивирования привлекает внимание исследователей в связи с его высокой эффективностью при накоплении больших количеств клеток. Оказалось, что клетки линий перевиваемых, в отличие от остальных типов клеточных культур, могут длительно культивироваться во взвешенном состоянии. Клетки в этих условиях размножаются, а не прикрепляясь к стенкам культуральной сосуды, находясь в суспензионном состоянии, благодаря постоянному перемешиванию среды. При оптимальном режиме выращивания клетки в суспензиях быстро размножаются, имеют более высокий «урожай», чем в стационарных культурах. Первичные линии клеток перевиваемых имеют неодинаковую способность роста в суспензии. Так, гетероплоидни и анеуплоидные постоянные линии, в отличие от псевдодиплоидних линий, адаптируются быстрее к росту в суспензии.
Суспензионные культуры готовят из однослойных культур. Клетки отслаивают от стекла с помощью растворов Версену и трипсина.
ru | allref.com.ua/ru/skachaty/Kul-tu...sologiya)?page=4


18.10.17
[1]
переходы:2
Культуры клеток и их условия выращивания
молекулы образуют защитный слой вокруг клетки, предотвращает повреждение клеток при перемешивании среды. Весьма важным показателем состояния суспензионной культуры является парциальное давление кислорода в жидкой фазе. Концентрация кислорода в газовой фазе зависит от плотности клеточной популяции и нередко бывает ниже атмосферной. Недостаток кислорода ведет к появлению грануляции цитоплазмы, клетки теряют правильную округлую форму. При небольшом избытке кислорода клетки имеют хорошо очерченную, правильную, округлую форму, и становятся очень большими при повреждающему действию избытка кислорода. Оптимальная концентрация кислорода для различных клеточных культур находится в пределах от 9 до 17% или 293 мм рт. столба. При концентрации кислорода выше 20% происходит ингибирование клеточного роста. Так, при концентрации кислорода 24% размножение клеток почек эмбриона кролика (линия ERK) снижалось наполовину, а при 30% сводилось к нулю. Повышение концентрации кислорода токсическое действие на клеточный метаболизм.
Таким образом, размножение клеток в суспензии зависит от концентрации клеток в начальной суспензии, аэрации и рН среды, состав питательной среды, способа перемешивания, объема суспензии и других факторов.
Однородность суспензии, возможность длительного поддержания клеток в логарифмической фазе роста, перспективы математического моделирования процессов клеточного роста в зависимости от влияния факторов внешней среды, удобство многократного исследования физиологического состояния культуры клеток в суспензии, высокая экономичность метода -вот далеко не полный перечень преимуществ суспензионных культур
В 1967 г.. Van Werel предложил метод культивирования, сочетающий элементы монослойного и суспензионного выращивания клеток, который он назвал методом «микроносителей». Суть его заключается в том, что клетки прикрепляются и размножаются на поверхности полимерных шариков-частиц «микроносителей» (МН), которые содержатся в суспензии с помощью перемешивающего устройства, например мешалки. На одной частице МН диаметром 160-230 мм может поместиться 350-630 (или в среднем 460) клеток. В одном мл среды можно суспензуваты несколько тысяч частиц микроносителей, при этом общая площадь их составит от нескольких до 50 см2 / мл.
1) создание равномерных условий по всему объему сосуда, что делает возможным эффективно контролировать необходимые параметры (рН, р02 и др.) 2) получение высокой плотности клеточной популяции до 5-6 млн.
ru | allref.com.ua/uk/skachaty/Kul-tu...sologiya)?page=6


18.10.17
[1]
переходы:2
Культуры клеток и их условия выращивания
стадии, как правило, количество клеток уменьшается, во второй стадии популяция клеток увеличивается (логарифмическая стадия роста), в третьей стадии увеличения количества клеток не наблюдается (стационарная фаза). Если культивирования продолжить дальше, то окажется период уменьшения численности клеток-фаза логарифмического отмирания (фаза разрушения). Скорость размножения клеток в логарифмической фазе роста выражают временем генерации. Во время генерации имеется в виду период, необходимый для удвоения популяции клеток в культуре. Для суспензионного выращивания клеток важным условием является перемешивание жидкости, которое должно быть непрерывным и достаточно интенсивным, чтобы поддерживать клетки во взвешенном состоянии, препятствовать их осаждению и прикреплению к стенкам сосуда и в то же время не вызывать их механического повреждения.
Перемешивание суспензионных культур проводят лопастными магнитными мешалками, а также круговыми качелями. В настоящее время широко применяют вращения флаконов и бутылей вокруг продольной оси (15-40 об / мин). На магнитных мешалках скорость вращения составляет 100-200 об / мин. Скорость перемешивания зависит от объема культуры; малые объемы культуры требуют невысокой скорости, тогда как ее необходимо увеличить при больших объемах. Для предотвращения оседания клеток на внутренней поверхности сосуда проводят силиконируання. Силиконовое покрытие из-за своей гидрофобности препятствует прикреплению клеток к стенке сосуда.
Внутренние стенки культуральной сосуды смачивают 5% или 10% -ным раствором силикона и после испарения растворителя (бензольного, ацетонового) сосуды выдерживают при 85 ° С и 200 ° (соответственно в течение 30 и 60 мин). После охлаждения сосуды наполняют горячей бидистиллированной водой и оставляют на 2:00, затем их 3 раза ополаскивают бидистиллированной водой и высушивают при 100 ° С. Сосуды стерилизуют в сушильном шкафу при 170 ° С в течение 2:00.
Максимальный рост клеток в суспензии наблюдают при рН 7,0-7,2. Питательные среды, применяемые для выращивания клеток в суспензии, не отличаются от сред, используемых для выращивания клеточных линий в однослойной культуре
Суспензионные культуры потребляют в 2-7 раз больше глюкозы, чем монослойного. В процессе потребления глюкозы клетки выделяют в среду токсическое для них молочную кислоту. Потребление клетками глюкозы и выработки молочной кислоты идут параллельно и находятся в прямой зависимости от плотности клеточной популяции. Полезным оказалось увеличение в питательную среду инсулина в количестве от 40 до 200 ЕД на 1 л. Увеличение в питательную среду инсулина изменяет соотношение между количеством поглощенной глюкозы и выделенной молочной кислоты. Для клеток линии L указанный коэффициент может быть снижен с 74-81 до 37-38%.
Различные аминокислоты потребляются из питательной среды клетками растущих с неодинаковой скоростью. Отмечено, что регулярное увеличение аргинина (20-40 мг / л) и увеличение количества глутамина до 450 мг / л способствуют росту взвешенных культур.
ru | allref.com.ua/ru/skachaty/Kul-tu...sologiya)?page=5


18.10.17
[1]
переходы:2
Культуры клеток и их условия выращивания
энергично видполискуваты монослой и эту среду разлить по пробиркам. В этом случае в среде могут атипичные клетки, обладающие способностью образовывать колонии, пригодные для дальнейших пересевов.
После переноса культуры атипичных клеток в новую посуду наблюдение за основной культурой целесообразно продолжить, поскольку процесс вывода новой клеточной линии весьма сложен, и далеко не всегда отобранные атипичные элементы дают начало жизнеспособной линии клеток перевиваемых. Необходимо, чтобы вся работа по получению новых клеточных линий, продолжается в течение многих месяцев, проводилась с одними и теми же питательными средами, сыворотками животных и сериями антибиотиков.
Известны такие первичные культуры, как культура клеток почки золотистого хомячка (BHK), культура клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК), культура клеток почки зеленой мартышки (CV).
До недавнего времени тканевые культуры применялись в вирусологии преимущественно в виде однослойных стационарных культур. Во многих случаях этот метод выращивания клеток является незаменимым. Многолетний опыт показывает, что при использовании однослойных стационарных культур встречается ряд трудностей, связанных с огромными затратами рабочего времени и материалов. С этой точки зрения, выгоднее роллерных культуры, экономические, характеризуются оптимальным отношением полезной площади культивирования к объему питательной среды и открывают благоприятные возможности для накопления клеточной массы.
Термин «роллерных культуры» обозначает метод культивирования, при котором клеточный монослой располагается по всей цилиндрической поверхности сосудов горизонтально вращающихся и периодически омывается питательной средой. По определенным причинам некоторое количество клеток может в отдельных случаях быть взвешено в культуральной среде. В подобном варианте культуру клеток называют роллерных-суспензионной. "Урожайность" клеточной культуры будет тем больше, чем больше площадь, с которой собирают клетки. Исследователи использовали различные пути увеличения площади поверхности, на которой происходило прикрепление и размножение клеток. Для этого применяли различного характера основы с большой удельной поверхностью: твердую, губчатую, из шерсти, коллагена, на стеклянных спиралях и т.д. Широкое распространение эти методы не получили, так как значительно затрудняли манипуляции с клетками, но следует отметить описанную Л. С
Ратнером и В. А. Крикун методику многоярусного культивирования. Клетки культивировали в 1,5, 10 и 15-литровых бутылях, полностью загруженных овальными стеклянными трубками, расположенными параллельно продольной оси сосудов. Полезная площадь при этом возрастала по сравнению со стационарными однослойными культурами в сосудах того же объема в 20 раз. Культивирование проходило в 2 этапа. На первом этапе бутыли вращали вокруг горизонтальной оси с целью равномерного распределения клеток. В дальнейшем, когда клетки прикреплялись к стеклу, культивирование продолжалось в стационарном положении. Описанная культуральная система была успешно использована для культивирования вируса ящура.
ru | allref.com.ua/ru/skachaty/Kul-tu...sologiya)?page=3


18.10.17
[1]
переходы:2
Культуры клеток и их условия выращивания
Среда удаляют с клеточного монослоя и монослой промывают сбалансированными буферными солевыми растворами (СБСР) или фосфатно-солевым буфером (ФСБ) для удаления ингибиторов (антител), которые могут присутствовать в среде. Вирусные частицы суспендируют в небольшом количестве СБСР или ФСБ и адсорбируются клетками в течение 30 - 60 мин. После этого солевые растворы заменяются свежей средой.
Заражение вирусами культивируемых клеток вызывает характерные морфологические изменения клеток. Конечные дегенеративные клеточные процессы (цитопатогенность эффект, ЦПЭ) обнаруживаются только через несколько недель роста в присутствии вирусов, но в ряде случаев ЦПЭ обнаруживаются уже через 12 ч. Детали морфологических изменений оказываются различными в случае различных вирусов.
3. Голубев Д. Б.., Соминина А. А., Медведева М. Н. Руководство по применению клеточных культур в вирусологии.
ru | allref.com.ua/ru/skachaty/Kul-tu...sologiya)?page=8


18.10.17
[1]
переходы:2
Культуры клеток и их условия выращивания
Лишь отдельные клетки или группы клеток популяции на фоне дегенерации большей части клеточного пласта могут сохранить способность к росту и размножению. Эти клетки, обнаружив потенцию бесконечного размножения in vitro, при многократных перевивку дают начало культурам клеток перевиваемых.
Различают линии и штаммы клеток перевиваемых. Первым термином обозначают клетки перевиваемых характеризуются потенциальным бессмертием и, как правило, гетероплоидним кариотипом вторым термином - клетки, напивперевиваються, с диплоидным набором хромосом и ограниченной продолжительностью жизни in vitro. Появление и тех, и других клеток связано с процессом отбора в клеточной популяции первичных культур, является, таким образом, источником всех линий и штаммов клеток перевиваемых.
Основное преимущество линий клеток перевиваемых по сравнению с любой первичной культурой, состоит в потенции неограниченного размножения вне организма и относительной автономностью что сближает их с бактериями и одноклеточными простыми.
Способность клеток перевиваемых к бесконечному размножению in vitro знаменует собой качественный скачок, в результате которого клетки приобретают способность к автономному существованию, подобно микроорганизмов, выращиваемых на искусственных питательных средах. Совокупность изменений, приводящих к появлению у клеток таких особенностей, называют трансформацией, а клетки тканевых культур, перевиваемых - трансформированными.
Совершенствование техники культивирования клеток значительно расширило возможности получения клеточных линий, перевивалися, из самых разнообразных тканей животных и человека. При этом была обнаружена возрастная граница, выше которого ткани теряли бы способность адаптации к неограниченному росту in vitro, то есть к трансформации.
Другим источником клеточных линий перевиваемых являются злокачественные новообразования. В этом случае трансформация клеток происходит in vivo в результате развития патологического процесса, этиология которого во многом остается еще невыясненной.
Так, например, безуспешными были попытки получить клетки, перевивалися, из раковых опухолей желудка и молочных желез человека. С трудом удается адаптировать к жизни in vitro клетки плоскоклеточного рака кожи и слизистых оболочек. С другой стороны, сравнительно легко выводятся линии из тканей сарком и злокачественных опухолей нервной системы.
Особую категорию клеточных культур составляют штаммы, напивперевиваються, имеют диплоидный набор хромосом. Они выгодно сочетают в себе черты первичных клеток перевиваемых.
Первичной - называется культура, полученная из ткани и выращиваемая in vitro до начала субкультивированием, то есть до первого посева. Первичная культура лишена многих клеток, присутствующих в начальной ткани, поскольку не все клетки способны прикрепляться к субстрату и выжить in vitro.
ru | allref.com.ua/ru/skachaty/Kul-tu...sologiya)?page=1


18.10.17
[1]
переходы:0
Культуры клеток и их условия выращивания
- универсальность, обеспечивающая возможность использования их для первичных, диплоидных и гетероплоидних клеток. Важное значение имеют свойства МН, которые позволяют использовать их многократно.
Проведено исследование многих гранулированных препаратов различной химической природы, в частности из поперечно-сшитого (ПС) декстрана, ПС агарозы, Пс-поливинилпирролидон, полиакрилнитрята, пористого селикагелю, полистирола, капрона, нейлона, алюмосиликат с целью использования их в качестве микроносителей.
Несколько зарубежных фирм разработали коммерческие препараты микроносителей, готовые к употреблению: Цитодекс-1, 2, 3 (Франция, Швеция), Супербит (США, Англия), Биосилон (Дания). Стоимость перечисленных препаратов достаточно высока, поэтому необходимо проводить исследования по разработке и производству отечественных МН.
Культивирование клеток на микроносителях проводят в обычных ферментерах для суспензионного культивирования. В ферментере не должно быть каких-либо выступлений, карманов, чтобы предотвратить накопление микроносителей в застойных зонах. Поэтому разумно использовать ферментеры с круглым дном и гладкими стенками. Внутренняя поверхность ферментера должна быть силиконизированная для предотвращения прилипания микроносителей к стеклу или нержавеющей стали ферментера.
Для контроля за условиями, окружающих культуру, такими, как рН и О2, может быть использовано стандартное оборудование. Скорость перемешивания суспензии с носителем должна быть 40-60 об / мин
Концентрация цитодекса может варьировать от 0,5 до 5 мг / мл. Однако, при производстве профилактических вакцин, применяют обычно конечную концентрацию цитодекса, не превышает 1 мг / мл. Повышение концентрации до 3 мг / мл и выше создает дополнительные трудности, связанные с необходимостью перфузии питательной среды и частичной ее замены, что затрудняет технологический процесс.
Посевная концентрация клеток, а также условия культивирования на МН в первые часы в значительной степени определяют оптимальные параметры для пролиферации и максимального накопления клеток. Показано, занявший 10 клеток / мл линии почек обезьян (Vero) и диплоидных клеток фибробластов эмбриона человека (MRC-5), перевиваемая, в уменьшенном до 1/3 объема питательной среды и при периодическом включении мешалки (30 об / мин ) на одну минуту через каждый час в течение 4:00, с последующим добавлением питательной среды до конечного объема, ведет к увеличению пролиферации клеток и их количества по сравнению с контролем (полный объем питательной среды в момент посадки клеток и непрерывная работа мешалки с начала культивирования).
ru | allref.com.ua/ru/skachaty/Kul-tu...sologiya)?page=7